你知道什么是WB实验吗？

WB（Western Blot，蛋白免疫印迹）是一种常规的蛋白分析技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

WB实验的基本核心理念是抗原抗体的特异性反应，通过变性胶 SDS-PAGE 将不同分子量的蛋白质分离开，然后转移到固相载体 PVDF 膜上，再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。待目的蛋白和抗体充分结合后，用 TBST 洗脱液洗脱掉多余未结合的一抗，加入带有 HRP 标记的对应二抗，这样，我们的蛋白+一抗+二抗形成一个复合物，加以化学发光液，有靶蛋白的位置就会产生荧光，利用胶片或者化学发光仪就可以显现靶蛋白的条带显现。

WB的实验步骤

制样:裂解缓冲液或者超声处理(使用RIPA裂解液是需按照100:1加入蛋白酶抑制剂)。

电泳:根据蛋白大小确定合适的PAGE胶浓度，推荐上样量为20-30ug总蛋白。

转膜:湿转和半干转都可。但在待检测蛋白分子量较大或低内源水平湿转移方法更佳。洗膜:10min/次*3次。

封闭:含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1h。

洗膜:TBST中洗涤10min。

孵育一抗:一抗应在含5%BSA或5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中稀释，参考产品说明书选择合适的一抗稀释比例。5%推荐使用脱脂奶粉的TBST缓冲液，背景相对较低。一抗4°C孵过夜更好。

洗膜:10min/次*3次。

孵育二抗:建议在含5%脱脂牛奶TBST中稀释二抗参考生产商建议选择合适的二抗稀释比例。

洗膜:10min/次*3次。

检测:化学发光检测。