WB实验之蛋白胶注意事项（二）

1.未加样的孔应添加高浓度SDS LB平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。通常20μL样品（含5μL4*SDS LB),可用8-8.5uL4*SDSLB平衡。同理，点marker的lane也要加入同样体积的LB。

LB若在室温放置太久和新鲜的在比重上会有差异，在新旧LB靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。

2.增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集(可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰)。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭或者条带中空。

仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200uL(最少80uL,这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致)，而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6uL,最少2.5μL,最多10uL,10μL时内参基本已经开始粘车成一条线.带型出现波浪纹。